一、目的

學(xué)習(xí)細(xì)菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。

二、原理

在基因工程實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌是*的實(shí)驗(yàn)材料。質(zhì)粒的保存、增殖和轉(zhuǎn)化；基因文庫的建立等都離不開細(xì)菌。特別是常用的大腸桿菌。

大腸桿菌是含有長約3000kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上快速生長。當(dāng)大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其開始裂殖前，入一個(gè)滯后期。然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，以20~30min復(fù)制一代的速度增殖。zui后，當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長的濃度時(shí)，菌體密度就達(dá)到一個(gè)比較恒定的值，這一時(shí)期叫做細(xì)菌生長的飽和期。此時(shí)菌體密度可達(dá)到1×109~2×109/mL。

培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)室中zui常用的是LB培養(yǎng)基。

三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器

（一） 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌

（二） 試劑

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化鈉

4、1mol/LNaOH

5、瓊脂粉

6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）

（三）儀器

1、培養(yǎng)皿

2、帶帽試管

3、涂布器

4、滅菌鍋

5、無菌操作臺(tái)（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）

6、恒溫?fù)u床

四、操作步驟

（一）LB培養(yǎng)基的配制

配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950m1去離子水中加入：

細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10g

細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g

NaCl 10g

搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)*溶解，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH位至7.0。加入去離子水至總體積為lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為LB液體培養(yǎng)基。

LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加瓊脂粉15g/L。

（二）細(xì)菌的培養(yǎng)

（１）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)

1、過夜培養(yǎng)

⑴取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。

⑵用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個(gè)單菌落，接種于培養(yǎng)液中。

⑶蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37℃過夜培養(yǎng)。

２、大體積培養(yǎng)

⑴按1∶100的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。

⑵于37℃，約300r/min劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)。

（２）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。

平板劃線法分離單菌落

⑴采用無菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開始劃線。

⑵重新消毒接種環(huán)，從一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直至覆蓋整個(gè)平板。

⑶于37℃培養(yǎng)直至長出單菌落。