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ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法詳細(xì)介紹,速來圍觀
更新時(shí)間:2019-12-02   點(diǎn)擊次數(shù):818次

 要使ELISA測(cè)定得到準(zhǔn)確的結(jié)果,不論是定性的還是定量的,必須嚴(yán)格按照規(guī)定的方法制備試劑和實(shí)施測(cè)定。主要試劑的制備要點(diǎn)之前已經(jīng)講述過,其他一般性試劑,如包被緩沖液、洗滌液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應(yīng)終止液等,配制時(shí)不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存,使用前應(yīng)觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要,使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。
 
測(cè)定的實(shí)施中,應(yīng)力求各個(gè)步驟操作的標(biāo)準(zhǔn)化,下面以elisa試劑盒為例,介紹有關(guān)注意事項(xiàng)。

(一)加樣
在ELISA中除了包被外,一般需進(jìn)行45加樣。在定性測(cè)定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性,例如規(guī)定為加樣一滴。此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管,保持準(zhǔn)確的加樣姿勢(shì),使每滴液體的體積基本相同。在定量測(cè)定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出現(xiàn)氣泡。

(二)保溫
在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后,此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求,保溫容器是水浴箱,可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的,傳熱容易。如用保溫箱,空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中,以平衡溫度,這在室溫較低時(shí)geng為重要。加入底物后,反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20℃,ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,以便不時(shí)觀察,待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí),即可終止酶反應(yīng)。

(三)洗滌
洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)聚,但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA測(cè)定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附,而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯(吐溫,Tween)一類物質(zhì)即右達(dá)到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,為非離子型的表面張力物質(zhì),常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對(duì)聚山梨酯編號(hào),結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20,在ELISA中*為常用。它的洗滌效guo好,并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。
洗滌如不*,特別在*后一次,如有酶結(jié)合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾。

ELISA板的洗滌一般可采用以下方法:①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液;②將洗滌液注滿板孔;③放置2min,略作搖動(dòng);④吸干孔內(nèi)液,也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3~4次,有時(shí)甚至需洗5~6次。

(四)比色
如陰性對(duì)照顏色極淺,在定性測(cè)定中一般可采用目視比色。如用比色計(jì)測(cè)定結(jié)果,準(zhǔn)確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量。

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